Пцр какой метод исследования. Что такое анализ крови на пцр, и зачем он нужен

Диагностика инфекционных заболеваний – бактериальных и вирусных – направлена на раннее выявление возбудителей, что позволяет назначать раннюю и максимально эффективную терапию. Самым современным способом диагностики инфекций является ПЦР или полимеразная цепная реакция. Так что же это за метод, и для чего он нужен?

Суть полимеразной реакции

Любой микроорганизм и вирус содержат в своей структуре молекулы ДНК или РНК. У каждого из них эти соединения уникальны, поэтому, если выделить в анализе крови у детей или взрослых нуклеиновые кислоты, можно с абсолютной точностью поставить диагноз.

К сожалению, концентрация ДНК в образцах крови или других биологических материалах достаточно низка и с помощью обычных методов диагностики определить ее не получается. Чтобы справиться с этой проблемой, была изобретена полимеразная цепная реакция.

Сущность ПЦР заключается в специальной обработке образца крови, в результате чего в ней увеличивается концентрация ДНК молекул, определение типа которых в дальнейшем позволяет установить вид возбудителя и поставить диагноз.

Как сдать кровь на ПЦР

При подготовке к анализу следует придерживаться общих рекомендаций: не пить и не есть непосредственно перед анализом крови. Хотя для сдачи крови на ПЦР можно так строго не придерживаться этих требований, так как точность исследования не зависит от того, на сытый или голодный желудок был взят анализ.

Какие заболевания можно выявить с помощью ПЦР

С помощью ПЦР можно выявить практически любые вирусные и бактериальные заболевания. Для анализа используется не только кровь, но и другие биологические материалы: сперма, слюна, мазки из уретры и с шейки матки. Анализ крови будет информативен в том случае, если возбудитель конкретного заболевания проникает в кровь человека. Поэтому ПЦР крови назначают при следующих заболеваниях:

• вирусные гепатиты А, В, С, D и TT;
• цитомегаловирус;
• герпетическая инфекция (вирусы герпеса 1, 2 и 4-го типов);
• ВИЧ-инфекция
• энтеровирусная инфекция;
• опоясывающий лишай;
• краснуха;
• токсоплазмоз;
• инфекционный мононуклеоз;
• листериоз.

Если же взять во внимание возможность проведения ПЦР других биоматериалов, то в список заболеваний, выявляемых с помощью ПЦР, следует добавить:

• гарднереллез;
• сальмонеллез;
• (порядка 100 различных штаммов вируса папилломы человека);
• трихомониаз;

Особо актуально в настоящее время ПЦР анализа крови беременной на так называемые : цитомегаловирус, токсоплазмоз, краснуху и . Связано это с тем, что упомянутые заболевания могут привести к аномалиям развития плода.

Преимущества ПЦР

Недостатки анализа

ПЦР является высокотехнологичным методом исследованием и предъявляет высокие требования к оснащению лаборатории. Помещение, где делают анализ, обязательно должно быть оснащено фильтром биологической очистки, так как в воздухе постоянно присутствуют частицы кожи, слюны, содержащие в своем составе молекулы ДНК. Несоблюдение техники работы с биоматериалами может стать причиной неверного результата.

Анализ крови – расшифровка у взрослых (ПЦР)

Трактовка результатов этого исследования не представляет сложностей, потому что отсутствует таблица норм анализа крови на ПЦР. В бланке результатов могут фигурировать лишь две фразы:

• отрицательный результат – возбудитель, на который проводился анализ, не выявлен;
• положительный результат – в организме имеется возбудитель указанного заболевания.

Следует знать, что ПЦР может быть положительной даже при отсутствии клинических симптомов заболевания! Расшифровка анализа крови на ПЦР у детей не отличается от таковой у взрослых.

Кому нужно сдать анализ на ПЦР

Любой человек может сдать кровь для исследования. Прямым показанием для исследования является подозрение на инфекции передающиеся половым путем ( , гарднереллез, ВИЧ-инфекция). При случайном незащищенный половом контакте только ПЦР поможет поставить диагноз на ранней стадии, если человек заразился каким-либо заболеванием. В обязательном порядке кровь на TORCH-комплекс сдают беременные женщины. А также женщины, только .

ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия

имени -Ясенецкого Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »

Кафедра медицинской генетики и клинической нейрофизиологии ИПО

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Методическое пособие для студентов 3-4 курсов

по специальностям лечебное дело (060101) и

Красноярск - 2007

Шнайдер, Н. А., Бутьянов, Р. А. Основные принципы метода полимеразной цепной реакции. Методическое пособие для внеаудиторной работы студентов 3-4 курсов по специальностям лечебное дело (060101) и педиатрия (060103). – Красноярск: Изд-во ГОУ ВПО КрасГМА, 2007. – 42с.

Методическое пособие полностью соответствует требованиям Государственного стандарта (2000) и отражает основные аспекты современного метода диагностики наследственных заболеваний человека – метода полимеразной цепной реакции, учебный материал адаптирован к образовательным технологиям с учетом специфики обучения на 3-4 курсах лечебного и педиатрического факультетов.

Рецензенты: заведующая кафедрой медицинской генетики ГОУ ВПО

«Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», д. м.н., профессор;

Репликация ДНК

Объектом исследования данного метода является Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). ДНК является универсальным носителем генетической инфор­мации у всех существующих на Земле организмов (исключение - РНК-содержащие микроорганиз­мы). ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из соеди­ненных последовательно нуклеотидов. Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5"-концу одной нити соответствует 3"-конец второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. Данный процесс называется репликацией . Репликация молекулы ДНК происходит в синтетический период интерфазы. Каждая из двух цепей «материнской» молекулы служит матрицей для «дочерней». После репликации вновь синтезированная молекула ДНК содержит одну «материнскую» цепочку, а вторую - «дочернюю», вновь синтезированную (полуконсервативный способ). Для матричного синтеза новой молекулы ДНК необходимо, чтобы старая молекула была деспирализована и вытянута. Репликация начинается в нескольких местах молекулы ДНК. Участок молекулы ДНК от точки начала одной репликации до точки начала другой называется репликоном .

Начало репликации активируется праймерами (затравками), состоящими из 100-200 пар нуклеотидов. Фермент ДНК-хеликаза раскручивает и разделяет материнскую спираль ДНК на две нити, на которых по принципу комплементарности при участии фермента ДНК-полимеразы собираются «дочерние» цепи ДНК. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока - небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии праймера, с комплиментарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. В каждом репликоне ДНК-полимераза может двигаться вдоль «материнской» нити только в одном направлении (5`=>3`).

На лидирующей нити по мере раскручивания репликона постепенно непрерывно наращивается «дочерняя» цепь. На отстающей нити дочерняя цепь синтезирует также в направлении (5`=>3`), но отдельными фрагментами по мере раскручивания репликона.

Таким образом, присоединение комплементарных нуклеотидов «дочерних» нитей идет в противоположных направлениях (антипараллельно). Репликация во всех репликонах идет одновременно. Фрагменты и части «дочерних» нитей, синтезированные в разных репликонах, сшиваются в единую нить ферментом лигазой. Репликация характеризуется полуконсервативностью, антипараллельностью и прерывистостью. Весь генном клетки реплицируется один раз за период времени, соответствующий одному митотическому циклу. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная (рис. 1).

Рис. 1. Схема репликации молекулы ДНК.

Таким образом, цикл репликации ДНК включает в себя три основные стадии:

1. расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация);

2. присоединение праймеров;

3. достраивание цепи дочерней нити.

Принцип метода ПЦР

Именно репликация ДНК легла в основе ПЦР. В ПЦР перечисленные выше процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании рас­твора до 93-95°С происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу - присоедине­нию или "отжигу" праймеров - инкубационную смесь охлаждают до 50-65°С. Далее смесь нагревают до 70-72°С - оптимум работы taq-ДНК-полимеразы - на этой стадии происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Другими словами метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация ) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК - полимеразой.

Наращивание дочерних нитей ДНК должно идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, поэтому для репликации второй цепи также требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера: один для "+"-цепи, второй для "-"-цепи. Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.

Этапы ПЦР

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающие при различных температурных режимах (рис. 2).

· 1 этап: денатурация ДНК. Протекает при 93-95° в течение 30-40 сек.

· 2 этап: отжиг праймеров. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответст­вующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического уча­стка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой распола­гаются в интервале 50-65°С. Время отжига 20-60 сек.

· 3 этап: достраивание цепей ДНК.Комплиментарное достраивание цепей ДНК происходит от 5"-конца к 3"-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения прай­меров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом taq-полимеразой и проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК–ампликона (рис. 3). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей.

Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2", где п - число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента ме­тодом электрофореза в агарозном геле.

Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе ), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:

· ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

· Праймеры (синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.

· Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК в эквивалентных концентрациях 200-500 мкм)

· Фермент Taq -полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК, 2-3 мМ).

· Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента, PH 6,8-7,8).

Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов , сначало получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции (RT), катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).

Рис. 2. Амплификация (1-ый цикл).

Рис. 3. Амплификация (2-ой цикл).

Основные области применения ПЦР

· клиническая медицина:

o диагностика инфекций,

o выявление мутаций, в том числе диагностика наследственных заболеваний,

o генотипирование, в том числе HLA-генотипирование,

o клеточные технологии

· экология (как способ мониторинга состояния и качества объектов окружающей среды и продуктов питания)

· определение трансгенных организмов (ГМО)

· идентификация личности, установление отцовства, криминалистика

· общая и частная биология,

Основные принципы

организации диагностических лабораторий

Работы в ПЦР-лаборатории проводятся согласно "Правилам устройства, техники безопасности , производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в ла­бораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждениях системы здравоохранения.

Контаминация образцов ДНК

Проведение ПЦР-диагностики связано с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов; ДНК-стандарта, используемого в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложноположительных результатов.

В процессе работы могут встретиться два вида контаминации :

1. перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположи­тельных результатов;

2. контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, т. к. в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продук­тами для реамплификации.

Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабора­торного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов. Определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных за­трат времени и средств. Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, исполь­зующих метод ПЦР для диагностики позволяет сформулировать основные требования к организа­ции таких лабораторий и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований позволяет исключить возможность контаминации и получения ложноположительных результатов.

Стадии проведения ПЦР анализа

Территориально разделяют, размещая их в отдельных помещениях (рис.4,5):

· Пре-ПЦР-помещение, где производится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с исследуемыми агентами, ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

· Пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации. В этом помещении допускается использовать другие методы детекции. Желательно комнату детекции продуктов амплификации расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

Рабочие помещения оснащены ультрафиолетовыми лампами с максимумом излучения в области 260 нм (типа ДБ-60) из расчета 2,5 Вт на 1 м3. Лампы расположены так, чтобы прямому облучению подвергались поверхности рабочих столов, оборудование и материалы, с которыми имеет контакт оператор во время проведения ПЦР-анализа. Облучение проводится в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

Врачи-лаборанты работают в специальной лабораторной одежде, сменяемой при переходе из одного помещения в другое, и в одноразовых перчатках. Обработка одежды из разных помещений произво­дится отдельно. На разных этапах проведения ПЦР-анализа работают различные сотрудники.

Для работы используют отдельные наборы дозаторов, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования , халатов и перчаток предназначенные для различных стадий анализа и не переносимые из одного помещения в другое. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате имеют соответствующую маркировку.

Все этапы работы проводят только с использованием одноразовых расходуемых материалов: наконечников для автоматических пипеток, пробирок, перчаток и т. д. Обязательно меняют наконечни­ки при переходе от пробы к пробе. Необходимо использовать наконечники с фильтром - аэрозоль­ным барьером для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники сбрасываются в специальные контейнеры или емкости, содержа­щие дезинфицирующий раствор. Клинические образцы хранят отдельно от реагентов.

Для обработки и уборки рабочего места в каждом помещении имеется ватно-марлевые тампоны (салфетки), пинцет, дезинфицирующий и инактивирующий растворы.

В ПЦР-диагностической лаборатории исключается проведение работ, связанных с получени­ем (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, которые диагностируются в данной лаборатории.

Забор клинического материала

Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты.

Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.

Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150°С в течение 1 часа.

Зона детекции (другой этаж или другое здание).

Рис. 4. Устройство ПЦР-лаборатории с детекцией электрофорезом.

Зона детекции (другой этаж или другое здание)

Рис. 5. Устройство ПЦР-лаборатории с флуоресцентной детекцией (количественный анализ).

Рис. 6. Комната выделения ДНК. Показан настольный бокс с бактерицидной лампой.

Рис. 7. Комната амплификации.

Рис. 8. Комната детекции.

Рис. 9. Образцы крови для ДНК-диагностик наследственных заболеваний .

Хранение и транспортировка образцов

Для диагностики наследственных заболеваний образцы крови хранятся на специальных бумажных бланках или в эпиндорфах (пластиковых пробирках) в замороженном состоянии в течение длительного времени (рис. 9).

Для диагностики инфекционных заболеваний образцы находятся при комнатной температуре не более 2-х часов. При необходимости более длительного хранения пробы могут быть помещены в холодильник с температурой 2-8°С на срок не более суток. Более продолжительное хранение (до 2-х недель) допустимо в замороженном виде в морозильной камере при температуре минус 20°С. Не допускается повторное замораживание-оттаивание проб.

Если ПЦР-диагностическая лаборатория и процедурный кабинет для забора проб территориально разобщены, то транспортировка проб должна осуществляться в термосах или термоконтейнерах с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортировки инфекционных материалов.

Выделение ДНК из образцов

Широкую распространенность получил метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократной отмывки и ресорбции ДНК буферным раствором. В случае обработки сыворотки, плазмы или цельной крови обычно используется метод фенольной экстракции. Метод включает депротеинизацию фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК (или РНК) этанолом или изопропанолом. Обработка произво­дится в микроцентрифужных пробирках типа «Eppendor P» объемом 1,5 мл. Время обработки составляет 1,5-2 часа (рис.10).

Рис. 10. Выделение ДНК.

Проведение ПЦР

Определенное количество образца из обработанной клинической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку типа «Eppendorf"» объемом 0,2 или 0,5 мл. В эту же пробирку добавляется амплификационная смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера, раствора дНТФ, раствора праймеров и раствора Taq-полимеразы (добавляется в смесь в последнюю очередь). Как правило, объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Затем в каждую пробирку добавляется одна капля минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе амплификации. Пробирки переносятся в программируемый термостат (амплификатор), где проводится амплификация в автоматическом режиме по заданной программе (рис. 11).

Рис. 11. Амплификатор « Thermocycler ».

Время проведения реакции в зависимости от заданной программы составляет 2-3 часа. Параллельно с опытными пробами ставятся контрольные: положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого гена. Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК вследствие контаминации и исключить учет ложноположительных результатов.

Регистрация результатов

Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчи­вое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм. В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5% до 2,5%. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50-60°С смесь заливают в форму слоем толщиной 4-6 мм и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы 0,5-1 мм. После застывания геля в карманы наносится амплификат в количестве 5-15 мкл. Рекомен­дуется параллельно с контрольными и опытными пробами проводить электрофорез смеси маркеров длин фрагментов ДНК. Обычно такая смесь содержит десять фрагментов ДНК длинной 100, 200, 300 и т. д. пар оснований.

Постановка такой пробы позволяет верифицировать длину ампликонов в контрольных и опытных пробах. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером, камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин при напряженности электрического поля 10-15 В/см. При этом фронт красителя, входящего в состав реакционной смеси должен пройти не менее 3 см.

После окончания электрофореза гель переносят на стекло трансиллюминатора и просматривают в ультрафиолетовом свете. Для документирования гель фотографируют на пленку типа "Микрат 300" или регистрируют с помощью видеосистемы, соединенной с компьютером.

В первую очередь оценивают контрольные пробы. В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать указанной в инструкции длине ампликона.

В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие такой полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации - загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном. Опытные пробы оценивают по наличию в соответствующей дорожке полосы, которая располагается на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе. Интенсивность свечения полосы соответствует количеству исследуемой ДНК в пробе, что позволяет проводить полуколичественную оценку ПЦР. Обычно положительные результаты оценивают по четырехбальной шкале. Если же свечение полосы в опытной пробе очень слабое, то такую пробу следует переставить (рис. 12).

Рис. 12. Электрофорез в агарозном геле.

Применения ПЦР для диагностики точковых мутаций и полиморфизмов генов

Одним из ведущих направлений применения ПЦР в практическом здравоохранении является диагностика точковых мутаций и полиморфизмов генов. Выделяют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики. В тех ситуациях, когда известен ген, повреждение которого приводит к развитию наследственного заболевания, можно это повреждение обнаружить молекулярно – генетическими методами. Такие методы называются прямыми. С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100%.

Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях :

· при известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания;

· должен быть клонирован ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность.

Целью прямой ДНК-диагностики является идентификация мутантных аллелей.

Таким образом, в тех ситуациях, когда известно, какое именно повреждение ДНК приводит к наследственному заболеванию, исследуется непосредственно фрагмент ДНК, содержащий повреждение, т. е. используется прямой метод ДНК-диагностики.

Однако к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. Поэтому в тех случаях, когда локализация повреждения не известна, используется другой подход, связанный с изучением окрестности гена, ответственного за генное заболевание, в сочетании с семейным анализом, то есть используются косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней.

Для выявления точковых мутаций и небольших делеций могут использоваться различные способы, однако все они основаны на использовании метода ПЦР. Данная реакция позволяет многократно умножить нуклеотидную последовательность ДНК, а затем осуществить поиск мутаций. Методы поиска фрагментов ДНК, несущих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных нуклеотидных последовательностей ДНК.

Анализ продуктов ПЦР

в процессе прямой ДНК-диагностики

Предполагает исследование конкретных особенностей амплифицорованного участка гена. Так, при заболеваниях, обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов, продукты амплификации различаются по своей длине (отражающей различное число триплетов в изучаемом участке гена) и, как следствие – по их скорости движения в геле. Благодаря этому достигается четкое электрофоретическое разделение нормальных и мутантных аллелей и точное определение патологически удлиненного фрагмента, т. е. ДНК-диагностика болезни (рис. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Рис. 14. Диагностика делеции GAG в гене DYT 1 у больных дофа-независимой дистонией (электрофорез в полиакриламидном геле). Дорожки 2,3,6 – больные; дорожки 1,4,5 – контроль. Тонкой стрелкой обозначен нормальный аллель, жирной стрелкой – мутантный более короткий аллель (делеция трех нуклеотидов).

Если исследуемый участок ДНК целиком входит в состав протяженной делеции, то ПЦР-амплификация ДНК с данного делетированного аллеля осуществляеться не будет в связи с отсутствием мест для гибридизации праймеров. При этом гомозиготная делеция будет диагностирована на основании полного отсутствия ПЦР-продукта реакции (синтез ДНК невозможен с обеих копий гена). При гетерозиготной делеции возможно выявление ПЦР-продукта, синтезированного с нормального (сохранного) аллеля, однако для достоверной диагностики такой мутации необходимо использование более сложных методов визуализации ДНК, позволяющих оценить дозу конечного ПЦР-продукта.

Для выявления точковых мутаций (чаще всего нуклеотидных замен) в определенных сайтах метод ПЦР используется в комбинации с другими методами молекулярно-генетического анализа. Если место локализации и характер предполагаемой точковой мутации точно известны, то для целенаправленного выявления такой мутации могут использоваться рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы ) – особые клеточные ферменты, выделяемые из различных штаммов бактерий.

Данные ферменты распознают специфические нуклеотидные последовательности длиной от четырех до десяти нуклеотидов. После чего осуществляют рестрикцию (лат. (разрезание) этих последовательностей в составе двунитевой молекулы ДНК. Каждая рестриктаза распознает и разрезает в фиксированном месте строго определенную, специфичную для себя нуклеотидную последовательность – сайт рестрикции (сайт узнавания).

В тех случаях, когда точковая мутация изменяет естественный сайт узнавания для определенной рестриктазы, данный фермент не сможет расщепить мутантный амплифицированный в ПЦР фрагмент. В некоторых случаях, мутация приводит к появлению нового сайта узнавания для той или иной рестриктазы, отсутствующего в норме.

В обеих ситуациях мутантный и нормальный ПЦР-продукты, обработанные выбранной рестриктазой, дадут различные по длине фрагменты рестрикции, что можно будет легко обнаружить при электрофорезе (рис. 15).

Таким образом, при необходимости быстрой детекции какой – либо конкретной точковой мутации задача сводится к поиску соответствующей рестриктазы, сайт узнавания которой локализован в месте нарушенной нуклеотидной последовательности. Обработка ПЦР-продуктов такой рестриктазой позволит легко дифференцировать нормальные и мутантные аллели. Рестрикционный анализ значительно упрощает обнаружение известных точковых мутаций и в настоящее время широко используется для прямой ДНК-диагностики наследственных заболеваний.

Заключительным этапом молекулярно-генетического анализа мутаций является определение нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента ДНК (секвенирование), которая сравнивается с нормой и формулируется окончательный генетический диагноз. Благодаря успехам молекулярной генетики в настоящее время разработаны методы ДНК-диагностики более 400 наследственных болезней.

Рис. 15. Выявление точковой мутации с помощью рестрикционного анализа: А – амплифицируемый участок гена, содержащий сайт рестрикции AGCT для рестрикционной эндонуклеазы Alu I . Мутация G → A изменяет данную нуклеотидную последовательность, в результате чего рестрикция ферментом AluI блокируется; Б – электрофореграмма продуктов рестрикции: дорожка 1 – гомозиготность по нормальному аллелю; дорожка 2 – гомозиготность по мутации; дорожка 3 – гетерозиготное состояние (нормальный аллель + мутация).

Диагностика наследственных болезней, основанная на прямом исследовании мутантных аллелей у больных, членов их семей или предполагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций, пригодна для досимптоматической и пренатальной диагностики, которая может быть применена на самых ранних стадиях развития плода, до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов болезни.

Независимо от метода детекции мутаций точные молекулярные характеристики каждой мутации могут быть получены только путем прямого секвенирования. Для автоматизации этого процесса в последние годы широко используется специальные аппараты – секвенаторы, которые дают возможность значительно ускорить процесс считывания ДНК-информации.

Путь для более широкого применения молекулярно-биологических исследований в клинико-диагностических лабораториях открывают ускорение аналитического процесса за счет выполнения всех процедур в одном континууме, без переноса пробы, создание условий для предотвращения контаминации при параллельном исследовании ряда аналитов и при объективной регистрации результатов в каждом цикле.

Основные модификации метода ПЦР

Используются для быстрого сканирования и поиска известных генных мутаций.

Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР

Данный метод основан на одновременной амплификации в одной реакции нескольких экзонов исследуемого гена. Это позволяет проводить экономный экспресс-скрининг наиболее частых мутаций. К примеру, для быстрой диагностики носительства делеций в гене дистрофина у больных прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшена/Беккера проводится одновременная амплификация набора наиболее часто мутирующих экзонов данного гена. Поскольку эти заболевания наследуются по Х-сцепленному рецессивному типу и связаны с повреждением у мальчиков единственной Х-хромросомы, в случае протяженной делеции при электрофорезе продуктов реакции будет выявлено отсутствие одного или нескольких фрагментов ДНК (экзонов), что может служить молекулярным подтверждением диагноза. Кроме этого, путем подбора для ПЦР-амплификации конкретных участков гена возможна достаточно точная оценка общей протяженности делеции и точек разрыва гена (в плоть до экзона).

Комбинированное использование нескольких мультиплексных реакций позволяет диагностировать до 98% всех делеций, имеющих место у больных прогрессрующей мышечной дистрофией Дюшенна/Беккера. Это составляет приблизительно 60% от общего числа известных мутаций в гене дистрофина и свидетельствует о весьма высокой эффективности данного скринингового метода ДНК-диагностики дистрофинопатий (рис. 16).

Рис. 16. Прямая ДНК-диагностика мышечной дистрофии Дюшенна с помощью мультиплексной ПЦР (электрофорез в агарозном геле). У каждого из обследуемых лиц одновременно амплифицированы четыре экзона гена дистрофина (экзоны 17, 19, 44 и 45; стрелки указывают на соответствующие продукты амплификации). Дорожка 1 – контроль, дорожки 2-5 – больные мышечной дистрофией Дюшенна с различными делециями гена дистрофина (дорожки 2 и 5 – делеция экзона 45, дорожка 3 – делеция экзона 44, дорожка 4 – делеция экзона 17 и 19).

Аллель-специфическая амплификация

Метод основан на использовании двух самостоятельных пар праймеров к конкретному участку гена: один праймер в обеих парах является общим, а второй праймер в каждой паре имеет различную структуру и является комплементарным либо нормальной, либо мутантной последовательности ДНК. В результате такой реакции в растворе одновременно могут синтезироваться две разновидности ПЦР-продуктов – нормальные и мутантные. Причем дизайн используемых праймеров дает возможность четко дифференцировать нормальные и мутантные продукты амплификации по их молекулярному размеру. Данный метод является очень наглядным и позволяет верифицировать как гомо-, так и гетерозиготное носительство мутантного аллеля.

Метод сайт-направленной модификации амплифицированной ДНК

Метод основан на использовании в ПЦР так называемого mismatch-праймера (не полностью комплементарного матрице), который отличается от матричной ДНК-последовательности на один нуклеотид. В результате включения указанного праймера в состав мутантного ПЦР-продукта в нем образуется искусственно созданный сайт рестрикции для одной из рестрикционных эндонуклеаз, что позволяет провести прямую ДНК-диагностику определенной известной мутации с помощью рестрикционного анализа. Создание такого искусственного сайта рестрикции бывает необходимо в том случае, если проведенный поиск не выявил существование известного и доступного фермента, «естественный» сайт рестрикции которого затрагивается в результате появления в молекуле ДНК исследуемой мутации.

Метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT - PCR )

Данный метод используется в тех случаях, когда в качестве объекта исследования удобнее использовать не генномную ДНК, а более компактную и информационно «насыщенную» кДНК, получаемую после соответствующей обработки образцов тканей, например биопсийного материала или клеточных линий лимфоцитов, фибробластов и т. д. Важным условие здесь является экспрессия (хотя бы минимальная) нужного гена в исследуемой ткани.

На первом этапе проводится обратная транскрипция мРНК, и получаемые молекулы кДНК служат матрицей для ПЦР. В последующем амплифицированный в достаточном количестве критический участок кДНК подвергается секвенированию и другим методам мутационного скрининга, прямому электорофоретическому исследованию (выявление делеций, вставок и т. д.) либо встраиванию в экспрессионную систему с целью получения белкового продукта и его непосредственного анализа.

Данный метод особенно эффективен для детекции мутаций, ведущих к синтезу «усеченного» белка (нонсенс-мутации, мутации сплайсинга, крупные делеции) – так называемый РТТ-анализ (Protein Truncation Test). РТТ-анализ обычно используется при исследовании протяженных мультиэкзонных генов, таких как ген мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, атаксии-телеангиоэктазии или нейрофиброматоза 1 типа.

ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR, англ.)

С каждым годом в практическом здравоохранении ПЦР в реальном времени становится все более востребованным методом диагностики. Его принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация, и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы успешно применяется в крупнейших санитарно-эпидемических, диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее сегодняшнем ("классическом") формате.

ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

Рис. 17. ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени использует TaqMan систему, контролирующую кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции используется зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5"-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата (рис. 17).

Основные преимущества ПЦР-Real-Time перед ПЦР с гель электрофорезом :

· Весь метод проходит в одной пробирке;

· Проведение метода занимает 1 час;

· Достаточно 1-2 рабочих комнат;

· Наряду с качественной оценкой результата появляется возможность количественной оценки (например, при назначении противовирусной терапии при СПИДе или вирусных гепатитах необходимо знать вирусную нагрузку, т. е. количество вируса на 1ед., что обеспечивает ПЦР real time);

· Резко снижается риск контаминации.

Заключение

Метод ПЦР является одним из наиболее распространенных методов молекулярно-биологических исследований. Данный метод должен применяться клиницистами осмысленно, и врач, решивший использовать ПЦР в своей, работе должен обладать определенными знаниями об особенностях и возможностях данного метода. Во-вторых, между клиницистом и ПЦР-лабораторией должна существовать тесная обратная связь, необходимая для анализа сложных слу­чаев и выработки правильной диагностической стратегии. В-третьих, ПЦР-анализ не является пана­цеей в диагностике (прежде всего инфекционных заболеваний) и не заменяет существующие методы исследований, а лишь дополняет их. И главное - ПЦР не может заменить интуицию и аналитическое мышление, которыми должен обла­дать врач, рассчитывающий на успех.

P . S . Молекулярно-биологические исследования - смена ориентиров диагностики и лечения. С применением молекулярно-биологических методов связывают перспективу радикальной смены акцентов в лабораторной диагностике. Речь может идти не просто о своевременной информации, а об ее заблаговременном получении. Если сейчас лабораторные исследования в большинстве случаев проводятся уже при развившейся болезни и начатом лечении, то молекулярно-биологическая лабораторная информация, как ожидают, даст возможность выявить наклонность человека к некоторым видам патологии и степень чувствительности к некоторым лекарствам, что позволит обосновать предсказательный, профилактический и персонализированный характер медицины будущего.

СМЕНА ОРИЕНТИРОВ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Сегодня В будущем

Диагноз Генетический паспорт

8. Сколько рабочих комнат необходимо для работы ПЦР-лаборатории с флуоресцентной детекцией (количественный анализ, Real-Time PCR)?

9. Что такое детекция?

10. Какие методы ДНК-диагностики выделяют?

11. Работа какого фермента лежит в основе ПЦР?

12. Почему зону детекции необходимо удалять от других рабочих зон?

13. Что такое сайт рестрикции?

14. В чем отличия прямого метода ДНК-диагностики от косвенного?

15. Что такое секвенирование?

16. Что такое мультиплексная ПЦР?

17. Какие типы мутаций определяют при помощи ПЦР?

18. Что такое контаминация?

19. В чем заключается сущность метода аллель-специфической амплификации?

20. Условия хранения материала для ПЦР?

21. В каком приборе проходит амплификация?

22. В чем заключается метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR)?

23. Что служит материалом для ПЦР-диагностики?

24. Перечислите виды контаминации?

Тесты для самоподготовки

1. Эндонуклеазные рестриктазы:

а) ферменты, «разрывающие» ДНК в строго специфических местах;

б) ферменты, сшивающие разрывы молекулы ДНК;

в) ферменты, обеспечивающие соединения, осуществляющие репарацию ДНК.

2. Амплификация генов:

3. Какой из методов молекулярной генетики применяется для диагностики болезней, обусловленных мутантным геном известной последовательности?

а) использование специфичной рестриктазы;

б) прямая детекция с использованием специфичных молекулярных зондов;

в) семейный анализ распределения нормального полиморфизма длины рестрикционных фрагментов.

4. Секвенирование ДНК:

а) идентификация последовательности оснований ДНК;

б) многократное повторение какого-либо участка ДНК;

в) выделение фрагмента ДНК, содержащего изучаемый ген.

5. Для получения образцов ДНК можно использовать :

б) ворсины хориона;

в) амниотическую жидкость;

г) клетки амниотической жидкости;

д) биоптаты кожи, мышц, печени,

е) все верно, кроме пункта «в»,

ж) все верно, кроме пункта «г»,

з) все вышеперечисленное верно.

6. Для диагностики каких мутаций применяется метод ПЦР:

а) геномные;

б) хромосомные;

в) генные (точечные).

7. Праймер это:

а) комплементарный участок ДНК;

б) синтетическая олигонуклеотидная меченая (радиоактивно или флюоресцентно) последовательность, комплементарная мутантному или нормальному гену;

в) олигонуклеотид, выполняющий роль «затравки» и инициирующий синтез полинуклеотидной цепи на ДНК- или РНК - матрице.

8. Кем был разработан принцип метода ПЦР?

б) К. Мюллис

9. Применяется ли метод ПЦР для диагностики экспансии тринуклеотидных повторов (динамического типа мутаций)?

10. В каких областях применяется ПЦР?

а) клиническая медицина;

б) определение трансгенных организмов (ГМО)

в) идентификация личности, установление отцовства, криминалистика

г) все вышеперечисленное,

д) ничего из вышеперечисленного..

Эталоны ответов: 1 – а; 2 – б; 3 – б; 4 – а; 5 – е; 6 – в; 7 – в; 8 – б; 9 – а, 10 – г.

Основная

1.Бочков генетика. Москва. ГЭОТАР, 2002.

Дополнительная

1. , Бахарев и лечение врожденных и наследственных заболеваний у детей. – Москва, 2004.

2. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование. – Москва, 2004.

3. Гинтер генетика. – Москва, 2003.

4. Горбунов основы медицинской генетики. – СПб.: Интермедика, 1999.

5. Херрингтон С., Дж. Макги. Молекулярная клиническая диагностика. – Мир, 1999.

6. Меньшиков -биологические исследования в клинической лабораторной диагностике: возможности проблемы (лекции). Клиническая лабораторная диагностика, № 3, 2006.

7. Корниенко работы ПЦР-лаборатории при поточном анализе биологического материала. Клиническая лабораторная диагностика, № 10, 2006.

8. Организация работы ПЦР-лаборатории. Методические указания. МУ 1.3.1794-03. Главный санитарный врач РФ, 2003.

9. Erlich H. A. PCR technology. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Real time quantitative PCR. Genome Res. – № 6, 1996.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Методическое пособие для внеаудиторной работы студентов 3-4 курсов по специальностям лечебное дело (060101) и педиатрия (060103).

ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Россия, Красноярск,

Метод полимеразной цепной реакции, или ПЦР, используется в лабораторной диагностике большинства инфекционных заболеваний. Он позволяет обнаружить в исследуемом материале генетический материал микроорганизмов и таким образом идентифицировать их.

Что это такое

Метод был разработан в 1983 году, а в 1993 году его автор – Мюллис – получил Нобелевскую премию.

Основы метода

ПЦР-анализ обнаруживает в исследуемом материале уникальный генетическй материал, позволяющий идентифицировать микроорганизм.

Каждый вид микроорганизмов, растений или животных имеет уникальный набор хромосом. Они образованы ДНК – дезоксирибонуклеиновой кислотой. Мелкие фрагменты ДНК называются нуклеотидами, а их определенная последовательность составляет ген. Каждый ген кодирует синтез одного белка, например, коллагена, альбумина и всех остальных. Последовательность нуклеотидов уникальна. Для каждого вида живых организмов существуют общие участки ДНК, отвечающие за однообразие в пределах этого вида.

Анализ ДНК нескольких сотен микробов, попавших в материал для исследования, не позволит выявить видовые закономерности. Необходимо во много раз увеличить количество значимых генетических компонентов, что даст возможность их идентифицировать. Эту задачу и решает метод ПЦР.

Исследование относится к области молекулярной биологии. К ДНК микроба добавляются ДНК-полимераза и свободные нуклеотиды. Полимераза – фермент, обеспечивающий многочисленное копирование нужного участка из имеющихся нуклеотидов. Запускают процесс праймеры – короткие нити рибонуклеиновой кислоты (РНК), прикрепляющиеся к началу нужного гена.

Процесс анализа состоит из нескольких фаз, каждая из которых требует определенного времени и температурного режима. В течение нескольких часов из тысячной доли грамма ДНК бактерий получается нужное количество материала для анализа. Современная аппаратура дает возможность многократно копировать ДНК даже одной клетки, например, сперматозоида.

Ход исследования

Этапы анализа:

• взятие биологического материала (крови, мочи, влагалищных выделений, слюны и так далее) у пациента и доставка в лабораторию;
• разделение двух нитей ДНК, переплетение которых образует хромосому, и очищение их от посторонних примесей;
• удвоение нужного участка нити ДНК, в результате ее количество растет в геометрической прогрессии;
• обработка полученного материала растворами, вызывающими специфическое свечение полученных фрагментов ДНК, по этому окрашиванию распознают, какая бактерия или вирус были в источнике; для разделения фракций ДНК используют электрофорез.

Длительность анализа составляет 4-5 часов.

Преимущества метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция обладает такими преимуществами перед традиционными способами определения возбудителей инфекции:

• прямое определение генов микроорганизма, в отличие от выявления антител к нему при многих других способах идентификации;
• специфичность, то есть определение конкретного вида возбудителя;
• чувствительность: для диагностики бывает достаточно даже одной клетки микроорганизма; в целом требуемое количество возбудителя в 10 раз меньше, чем для других методов;
• универсальность биоматериала – исследуется не только кровь, но и клетки плотных тканей, соскобы с эпителия, слизистые выделения и любые другие среды, где может быть микроб;
• скорость получения результата в несколько раз выше, чем при использовании других методов;
• возможность распознавания хронических, вялотекущих и скрытых инфекций;
• дезинфекция взятого у больного материала и исключение заражения сотрудников лаборатории;
• полная автоматизация процесса исследования.

Недостатки анализа

Минусы ПЦР связаны в основном с ее технической сложностью:

• необходимо правильно выбрать последовательности РНК – праймеры, а также приготовить смесь нуклеотидов для синтеза ДНК;
• метод очень чувствителен, поэтому если в образце есть разные виды микробов, он может давать неверные результаты;
• нужно тщательно очищать анализируемый материал от примесей белков человека и лекарств, так как они снижают точность диагностики;
• требуется контрольное сравнение результатов с образцами, заведомо содержащими или не содержащими материал микроорганизмов, а также вообще не включающими ДНК для определения ошибок и загрязнений.

Ложноотрицательные результаты ПЦР вызваны нарушением техники анализа и изменениями в генетической последовательности любого из компонентов реакции. Встречаются и ложноположительные данные – при случайном совпадении нуклеотидов праймеров и других применяемых реактивов с одним из генов микроорганизма.

Выделение микроорганизма не всегда говорит о том, что именно он стал причиной болезни. При анализе ДНК человека существует еще одна проблема: генетическая основа большинства заболеваний до сих пор неизвестна, что пока делает невозможной диагностику неинфекционной патологии на микробиологическом уровне. Это направление медицинской генетики очень активно развивается.

Показания для ПЦР-исследования

В большинстве случаев ПЦР-диагностику применяют у лиц с инфекционными заболеваниями с целью определения микроорганизма, вызвавшего болезнь.

Этот анализ используется в таких ситуациях:

• необходимость выявления и идентификации вирусов, бактерий, простейших при любых инфекционных заболеваниях, когда требуется точность диагностики;
• идентификация личности путем сравнения с генетическим материалом известного происхождения;
• анализ тканей, полученных путем тонкоигольной , которые очень трудно исследовать другими методами;
• диагностика лейкозов и злокачественных опухолей;
• проведение экспериментов с приживляемостью эмбриональных стволовых клеток у животных (у людей применение таких клеток запрещено), а также выведение линий лабораторных мышей с заранее заданным генетическим заболеванием.

Перспективы применения ПЦР-реакции и ее разновидностей в медицине и биологии захватывают воображение – от испытания новых лекарств на генном уровне до создания трансгенных организмов с заданными свойствами. Работы в этом направлении ведутся в крупнейших лабораториях мира, что помогает совершенствовать метод ПЦР и на прикладном уровне, для диагностики инфекционных болезней человека.

В медицине ПЦР-метод обычно используется для диагностики и оценки эффективности лечения таких заболеваний:

• внутриклеточные инфекции, например, или ;
• болезни, передающиеся при сексуальных контактах;
• инфекция Helicobacter pylori и многие другие.

Подготовка к исследованию

За 3 дня до выполнения исследования необходимо отказаться от употребления спиртных напитков. По назначению врача отменяются некоторые лекарственные препараты, например, антибиотики.

Правила подготовки при диагностике половых инфекций:

• за 2 дня до анализа прекратить половые контакты;
• за 2 часа до исследования не мочиться;
• накануне вечером и утром не спринцеваться; подмываться только теплой водой без моющих средств;
• не сдавать ПЦР во время и в течение 4 дней после (у женщин).

Общие правила подготовки:

• за 2 дня исключить интенсивные физические нагрузки, занятия спортом;
• с утра в день исследования не курить и не употреблять пищу;
• если материал будет браться из полости рта и носоглотки – утром не чистить зубы.

От выполнения этих простых правил зависит достоверность этого точного, но недешевого метода диагностики. Самостоятельная интерпретация результата не даст нужной информации о болезни и ее лечении. Вот поэтому после получения данных ПЦР-исследования необходимо обратиться к врачу.

К какому врачу обратиться

При подозрении на венерическое заболевание на ПЦР направляет гинеколог, уролог, андролог, венеролог. Исследование при гепатитах и ВИЧ-инфекции назначает инфекционист, при туберкулезе – фтизиатр. ПЦР в своей практике используют врачи многих специальностей, например, онкологи, гематологи, гастроэнтерологи, генетики.

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Метод полимеразной цепной реакции был открыт почти тридцать лет назад американским учёным по имени Кэрри Мюллис . Методика широко распространена в медицине в качестве диагностического инструмента, и суть её состоит в копировании участка ДНК при помощи специального фермента (полимеразы ) искусственным путём в пробирке.

В каких областях медицины применяется этот метод?

Для чего выполняется копирование ДНК и как это может послужить медицине?
Данная методика позволяет:

• Выделять и клонировать гены.
• Диагностировать генетические и инфекционные заболевания.
• Определять отцовство. Ребенок частично наследует от своих биологических родителей генетические особенности, однако имеет при этом свою собственную уникальную генетическую идентификацию. Наличие у него некоторых генов, идентичных родительским генам – позволяет говорить об установлении родства.

Полимеразная цепная реакция применяется также в криминалистической практике.

На месте преступления судмедэксперты собирают образцы генетических материалов. К ним относятся: волосы, слюна, кровь. Впоследствии, благодаря методике полимеразной реакции, можно амплифицировать ДНК и сравнить идентичность взятой пробы с генетическим материалом подозреваемого человека.

В медицине эффективно используется полимеразная цепная реакция:

• В пульмонологической практике – для дифференциации бактериальных и вирусных видов пневмонии , туберкулёза .
• В гинекологической и урологической практике – для определения уреаплазмоза , хламидиоза , микоплазменной инфекции , гарднереллеза , герпеса , гонореи .
• В гастроэнтерологической практике.
• В гематологии – для определения онковирусов и цитомегаловирусной инфекции .
• В экспресс-диагностике таких инфекционных заболеваний как вирусные гепатиты , дифтерия , сальмонеллёз .

В настоящее время наиболее распространен данный метод в диагностике инфекционных болезней (гепатитов вирусной этиологии, ВИЧ , венерических заболеваний , туберкулёза, клещевого энцефалита ).

Что происходит во время протекания реакции?

Сама реакция является химически несложной. Источником ДНК для реакции может послужить капля крови, волос, кусочек кожи, и т.д. В теории, для проведения реакции требуются нужные реагенты, пробирка, проба из биологического материала и источник тепла.

Полимеразная реакция позволяет выявить инфекцию, даже если в пробе с биологическим материалом находится всего одна или несколько ДНК-молекул возбудителя.

Во время протекания реакции, благодаря ферменту ДНК-полимеразы, происходит удвоение (репликация ) участка ДНК. Сама же дезоксирибонуклеиновая кислота (сокращенно ДНК ) важна для нас тем, что обеспечивает хранение и передачу дочерним клеткам генетической информации. ДНК имеет вид спирали, которая состоит из повторяющихся блоков. Эти блоки составляют нуклеотиды, которые являются наименьшей частицей ДНК. Нуклеотиды образуются из аминокислот.

Процесс репликации участков ДНК происходит во время повторяющихся циклов. В каждый такой цикл копируется и удваивается не только исходный фрагмент ДНК, но и те фрагменты, которые уже удвоились в прошлый цикл амплификации. Все это напоминает процесс геометрической прогрессии.

Существует:

• Естественная амплификация (то есть процесс копирования и размножения ДНК ), которая происходит в нашем организме и является детерминированным, предопределённым процессом.
• Искусственная амплификация, которая происходит благодаря полимеразной цепной реакции. В этом случае процесс копирования является управляемым и позволяет удвоить даже короткие участки нуклеиновой кислоты.

После завершения каждого цикла копирования, количество фрагментов нуклеиновой кислоты возрастает в геометрической прогрессии. Именно поэтому сам процесс называют «цепной реакцией».

Спустя тридцать - сорок циклов число фрагментов достигает нескольких миллиардов.

Для амплификации in vitro (в пробирке ) необходимо, чтобы в биосреде, взятой для диагностики, присутствовал специфический чужеродный фрагмент ДНК (то есть ДНК не пациента, а возбудителя ). Если в созданном растворе не будет находиться специфический фрагмент – цепная реакция под действием полимеразы не пойдет. Этим и объясняется факт высокой специфичности ПЦР.

Этапы ПЦР-диагностики

1. Из исследуемого материала выделяют ДНК.
2. Добавляют ДНК в специальный раствор из нуклеотидов.
3. Нагревают раствор до температуры 90 - 95 градусов Цельсия, для того, чтобы белок ДНК свернулся.
4. Снижают температуру до 60 градусов.
5. При повторении циклов повышения-понижения температуры количество участков нуклеиновой кислоты возрастает.

6. Путём проведения электрофореза подводится итог, и подсчитываются результаты удвоения.

Какие преимущества имеет данная диагностика?

• Универсальность: для этого метода подходят любые образцы нуклеиновой кислоты.
• Высокая специфичность: возбудитель имеет уникальные последовательности цепочек ДНК, которые свойственны именно ему. Поэтому результаты проведённой ПЦР будут достоверными, в них невозможно спутать ген одного возбудителя с геном другого возбудителя.
• Чувствительность к наличию даже единичной молекулы возбудителя.

• Маленький объем материала, нужного для исследования. Подойдет даже капля крови. Возможность получить результат, использовав минимальный объём пробы, очень важна для педиатрических, неонатологических, неврологических исследований, а также в практике судебной медицины.
• Возможность определения вялотекущей, хронической инфекции, а не только острой.
• Многие болезнетворные культуры очень сложно культивировать в пробирке другими методиками, а полимеразная реакция позволяет размножить культуру в нужном количестве.

Какие недостатки имеет данная диагностика?

• Если в материале, предназначенном для проведения ПЦР, находится ДНК не только живого возбудителя, но и погибшего – будет происходить амплификация обеих ДНК. Соответственно, лечение после диагностики может быть назначено не совсем верное. Через некоторое время лучше пройти контроль эффективности проведённого лечения.
• Повышенная чувствительность к наличию микроорганизмов тоже может считаться, в некотором роде, недостатком. Ведь в норме в человеческом организме присутствует условно-патогенная микрофлора, то есть это микроорганизмы, которые живут в кишечнике , желудке , других внутренних органах. Эти микроорганизмы могут принести вред человеку только при определенных неблагоприятных условиях – несоблюдение гигиенических требований, загрязненная питьевая вода и т.д. ПЦР-методика амплифицирует ДНК даже этих микроорганизмов, хотя они и не приводят к патологии.
• ПЦР разных тест-систем может показывать результаты, которые будут разниться между собой. Существует много модификаций данной методики: «вложенная », «ассиметричная », «инвертированная », «количественная » ПЦР и другие.

Современные высокотехнологичные методы лабораторного исследования позволяют определить болезни на начальной стадии. Инфекционные заболевания развиваются и эволюционируют, их становится все больше, а выявить их все сложнее. Диагностика методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) является одной из самых новейших и высокоточных. За ее разработку ученый Кэри Мюллис был награжден Нобелевской премией.

Полимеразная цепная реакция – метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий найти у людей разные виды инфекционных и наследственных патологий, как в острой и хронической форме, так и задолго до того, как патология начинает себя проявлять. Большинство врачей сталкиваются с этим анализом ежедневно и уже не представляют, как без него возможно поставить правильный диагноз и стадию болезни.

Суть ПЦР-диагностики

При анализе ПЦР используются принципы молекулярной биологии. При его проведении используются специальные ферменты, многократно копирующие фрагменты РНК и ДНК, а также микроорганизмы, возбуждающие заболевания и находящиеся в биологических материалах человека. Копирование происходит в несколько этапов, поэтому образуется цепная реакция. После этого специалисты лаборатории делают сверку полученных данных с общей базой и выявляют возбудителей заболевания, а также их концентрацию. Диагностику проводят в специальном приборе, который производит охлаждение и нагревание пробирки с биоматериалом и называется амплификатор. Соблюдение температурного режима влияет на правдивость результатов анализа.

Фрагменты ДНК микроорганизмов могут содержаться в следующих биологических материалах:

• биологические жидкости;
• кровь и ее производные;
• соскоб эпителиальных клеток или мазок;
• моча;
• мокрота;
• слизь и другие биологические выделения;
• биопаты слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Где применяется диагностика методом ПЦР

Возможности диагностики инфекционных заболеваний с применением полимеразной цепной реакции велики, с ее помощью можно определить самые разнообразные вирусы, вызывающие такие инфекции как:

Это не полный список заболеваний, которые выявляются с помощью анализа ПЦР. Большинство этих патологий на ранней стадии практически незаметны, но последствия от их воздействия на организм крайне негативные и часто опасные для здоровья и жизни человека.

Беременным женщинам назначают анализ ПЦРК, чтобы выявить инфекции, передающиеся половым путем, значительно увеличивающие риск появления рака шейки матки, пагубно влияющие на протекание беременности и здоровье ребенка. Поэтому крайне важна диагностика ЗППП, чтобы не допустить заражение плода патогенными микроорганизмами.

Исходя из всего вышеперечисленного можно сделать вывод, что лабораторная диагностика с применением метода ПЦР помогает врачу установить точный диагноз и назначить эффективную терапию в каждом индивидуальном случае.

Это интересно! Помимо медицины метод ПЦР применяется и в других сферах, например, в криминалистике, когда необходимо выявить кому принадлежит найденный на месте преступления биоматериал, а иногда ПЦР используется для определения отцовства, для проведения опытов с мутацией ДНК и других экспериментов.

Плюсы и минусы метода

Преимуществами диагностики методом ПЦР являются:

• большая чувствительность теста позволяет определить даже единичные агенты возбудителя, что дает возможность выявить патологию на ранней стадии, при хронической и скрытой форме;
• универсальность метода позволяет использовать почти любой биоматериал для исследования от слюны до клеток кожи;
• большой охват – при исследовании одного образца возможно определить наличие нескольких разных возбудителей заболеваний;
• точность – высокий уровень этого метода обследования позволяет не выдавать ложных показателей;
• скорость – результат готов в среднем за пять часов, то есть пациент на другой день после сдачи биоматериала уже может забрать заключение;
• относительно невысокая цена – данный метод диагностики по стоимости не отличается от других лабораторных анализов крови;
• используя этот метод, можно сделать доклиническую и ретроспективную диагностику. Первая выявляет патогенные микроорганизмы еще до проявления заболевания, а вторая проводится после перенесенной патологии, что позволяет не дать патологии развиться и вовремя ее вылечить, а также определить латентную форму заболевания, протекающую без явных симптомов.

Но совершенных методов диагностики не существует, поэтому и у ПЦР есть минусы:

• высокие требования к соблюдению технологического процесса;
• высокие требования к профессионализму лаборантов.

Совет! Проводить подобный анализ лучше только в самых хороших и профессиональных лабораториях, где внедрены строгие системы контроля за качеством работы.

Для достоверности результатов необходимо соблюдать правила по предварительной подготовке к анализу:

• при сдаче слюны нельзя кушать и пить медикаменты за четыре часа до анализа, перед процедурой надо промыть рот кипяченой водой, после этого провести небольшой массаж кожи для того, чтобы выделился секрет из железы;
• мочу как правило собирают дома. Перед этим необходимо помыть половые органы и собрать в специальный контейнер 50 мл первой утренней мочи, нецелесообразно собирать материал при менструации;
• перед сдачей спермы мужчине нужно трое суток не вступать от половую связь, не посещать сауну, не купаться в горячей ванне, не принимать алкогольные напитки и острую еду. Непосредственно перед анализом запрещено мочиться три часа;
• для сдачи урогенитального мазка рекомендовано отсутствие половых связей на протяжении трех суток. За две недели до анализа запрещен прием антибактериальных лекарств. За неделю надо перестать пользоваться интимными гелями, мазями, влагалищными свечами, не делать спринцевание. Три часа до взятия биоматериала необходимо воздерживаться от похода в туалет.
• кровь сдается в утреннее время на голодный желудок.

Материал для диагностики должен собираться в условиях, которые исключают его загрязнение, так как это в значительной мере может повлиять на правдивость результата ПЦР.

Расшифровка анализа

Анализ может показать положительный или отрицательный результат. Отрицательный значит, что в организме предполагаемые инфекции отсутствуют и человек здоров. Положительный говорит, что пациент болен и ему необходимо лечение. Любые показатели должен расшифровывать и озвучивать врач. Не стоит расстраиваться и пугаться плохих результатов, на основании них назначается терапия, главное не затягивать процесс и не заниматься самолечением.

Понравилась наша статья? Поделитесь с друзьями в соц. сетях или оцените эту запись:

Поставить оценку:

(Пока оценок нет)

Я врач терапевт, специалист широкого профиля. В моей компетенции находятся вопросы раннего диагностирования пациентов и лечения многих заболеваний желудочно-кишечного тракта, легких и дыхательных путей, печени, почек, сердечно-сосудистой и мочеполовой систем, кожных заболеваний, нарушений обмена веществ и пр. 15 лет опыта работы врачом терапевтом в поликлиниках Москвы, 5 из которых работал в одной больнице Санкт-Петербурга.. С радостью отвечу на вопросы читателей моего блога.